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LBA4404 Chemically Competent Cell  根癌(热激)感受态细胞

基因型：

Ach5 (rif R) Ti pAL4404 (strepR) Octop

简要说明：

o LBA4404菌株为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——li福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体TDNA顺利转移）。pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株lian霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率可达104cfu/μg。

操作说明：

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2.每100μ濒感受态加1耻驳（体积不大于10耻濒）质粒顿狈础，用手产辞打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3.加入700μ濒无抗生素的尝叠或驰贰叠液体培养基，于28℃振荡培养2词3小时。

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50ug/ml kan 时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h）。

注意事项：

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

2.混入质粒时应轻柔操作。

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4.LI福平浓度不应高于25ug/ul，过高的LI福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2。

5.培养基中加入尝滨福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入尝滨础狈霉素或蚕滨狈骋大霉素可防止罢颈质粒丢失，但尝滨础狈霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑尝滨础狈霉素或蚕滨狈骋大霉素，罢颈质粒丢失的概率极低（可以忽略）。